El 14 de abril de 1573 el hidalgo Juan de Garay partió desde Asunción con la intención de «abrir puertas a la tierra», para establecer un punto medio entre Asunción y el mar. Avanzando por el río de los Quiloazas, hoy llamado río San Javier, desembarca sobre la orilla sudoeste del río, y decide establecer un asentamiento con el nombre de Santa Fe, el 15 de noviembre de 1573, al que le da la categoría de ciudad. Este poblado, hoy en día conocido como las ruinas de Santa Fe la Vieja, se encontraba a 80 km al norte de la actual Cayastá, representando el centro de la tenencia de gobierno de Santa Fe.

La ciudad se edificaba en torno a la Plaza de Armas, con su Cabildo y su Iglesia Matriz. Tenía once manzanas de norte a sur y seis de este a oeste. Ochenta años duró la ciudad en este sitio, pero, debido a diversos problemas, siendo estos la hostilidad de los aborígenes locales (tobas, mocovíes, guaraníes, abipones y calchines), el avance del río y las deplorables condiciones para el tráfico de carretas, motivaron la mudanza de la ciudad al Rincón de la Estancia de don Juan de Lencinas, en el "Pago de la Vera Cruz". Diez años duró el traslado de la ciudad, desde 1650 a 1660. El Cabildo y la Iglesia Matriz ya estaban finalizados para entonces.

El 31 de diciembre de 1662 al puerto de Santa Fe se le era otorgado el título de "puerto preciso", por real cédula del rey Felipe IV, lo que favoreció al comercio local y el crecimiento de la población. A pesar del traslado, en los siguientes años se seguiría dando ataques por parte de los indígenas de la región, logrando paz por cortos periodos de tiempo. Pasando el año 1700, la miseria era mayúscula, a causa de las múltiples incursiones indígenas; las pestes que sufrían esporádicamente la población, el ganado o la cosecha; el pago de impuestos elevados; y la casi total dependencia hacia Buenos Aires. 

Sin embargo, una mejora en la situación se vivió a partir de 1733, con la designación de Francisco Javier de Echagüe y Andía como teniente de gobernador hasta su muerte en 1742, y con su sucesor, Francisco Antonio Vera Mujica, que gobernó hasta 1766. Ambos fueron buenos diplomáticos con los indígenas, además de que consolidaron el territorio de la gobernación, las reducciones, y levantaron levemente la economía local.

En 1780 el virrey Vértiz le retiró a Santa Fe el título de puerto preciso este cambios, junto con el recrudecimiento de la guerra contra el indígena, produjeron otra vez una decaída en el sector económico, social y político de la ciudad.
Los primeros años del siglo XIX siguieron la tónica de los anteriores. Se sucedieron pestes de escarlatina y de lepra, trece años seguidos de plagas de langostas y una pobreza generalizada. Sin embargo, el descontento se acrecentó debido a las dos contribuciones forzosas al virreinato y el nulo entusiasmo con el que era recibido el nombramiento de Cisneros como virrey,​ unido al creciente fervor revolucionario. Por 1809, se repartieron panfletos subversivos y se hablaba de una posible conspiración contra el poder colonial.

En 1810 sucedía la Revolución de Mayo y la creación del primer gobierno patrio, el cual el Cabildo de Santa Fe aceptaba el nuevo gobierno el 12 de junio y con Juan Francisco Tarragona como diputado de la Junta Grande, sin embargo, los acuerdos entre Buenos Aires y el virrey Elio, la fuerte centralización y la entrega de territorios hacia los realistas desembocaron en protestas de Santa Fe y un acercamiento progresivo a Artigas y la causa federal.​ Depuesto el anterior teniente, Prudencio Gastañaduy, la Junta designó al español Manuel Ruiz como su reemplazante, haciendo caso omiso a los pedidos de que fuera el santafesino Francisco Candioti.

El 24 de marzo de 1815, el último teniente de gobernador de Santa Fe, Eustoquio Díaz Vélez, enfrentado con la ciudad y con la idea de no empezar una guerra civil, decidió abandonarla ante el avance de un ejército artiguista al mando de Manuel Artigas y de Eusebio Hereñú, en el marco de la guerra sostenida por Artigas contra el Directorio. El 31 de marzo el cabildo santafesino nombraría para el cargo de gobernador interino a Francisco Candioti, iniciándose así como provincia autónoma. Luego, por abril de 1815, las tropas del ejército de Artigas se retirarían a Entre Ríos ante el avance de un ejército unitario porteño que Carlos María de Alvear mandaba contra Santa Fe, pero que se sublevó en Fortezuelas el 3 de abril de 1815, terminando con el derrocamiento del director supremo.

En su corto gobierno, Candioti intento apaciguar la frontera con el indígena, y envió a Buenos Aires a Mariano Vera para resolver el conflicto. Sin embargo, el director Álvarez Thomas envió un ejército de 3500 hombres, que se trasladó por el río Paraná, bajo el mando del general Juan José Viamonte y que ocuparían Santa Fe el 25 de agosto de 1815, dos días antes del fallecimiento de Candioti. Viamonte, junto a Tarragona, gobernaron a través de una Junta, que se superpuso en tareas y obligaciones con el Cabildo, que los rechazó.​ Desde ese momento se conforman dos bandos, los que apoyan a la Junta, y, por ende, al gobierno porteño; y los que apoyaban al Cabildo y la anterior autonomía.
El 2 de marzo de 1816, la 1.ª Compañía de Blandengues se sublevaba en Añapiré al mando del teniente Estanislao López y del coronel Pedro Lassaga, con ayuda de las milicias locales de Cosme Maciel y Javier Abálos y de una tropa enviada desde Paraná por Artigas al mando de José Francisco Rodríguez. Coordinados por el Cabildo, se enfrentaron a con las tropas de Viamonte, que se hallaban debilitadas a causa del constante envío de tropas al exterior, resultando victoriosas. Era la primera vez que Santa Fe se enfrentaba a los porteños por las armas. Aunque Terragona logró escapar, Viamonte fue arrestado y enviado al campamento de Artigas. Mariano Vera sería elegido gobernador de Santa Fe en las elecciones siguientes.

Luego de un período de enfrentamiento, el 9 de abril, Díaz Vélez y Cosme Maciel firman el Pacto de Santo Tomé, en el pueblo homónimo, retirándose Buenos Aires de la provincia. Siendo las vísperas del Congreso de Tucumán, Santa Fe enviaría a Juan Francisco Seguí como diputado, aunque poco después tendría que retornar a Santa Fe sin cumplir su tarea, y Buenos Aires dejaba sin valides lo estipulado en el pacto de Santo Tomé. En julio de 1816, mientras se declaraba la independencia de Argentina, Díaz Vélez avanzaba por tierra contra Santa Fe, apoyado por una cuadrilla en el río comandada por Matías de Irigoyen. Díaz Vélez retomaría la ciudad el 25 de julio, ya que Vera, aconsejado por Estanislao López, decidió retirarse con sus fuerzas a las afueras de la ciudad, y hostigo a las fuerzas porteñas los siguientes días. El 30 de agosto, las tropas porteñas se retirarían de la ciudad, luego de un mes de sitio, dejando Vera que se marchen sin detenerlos.

Luego de dos años de gobierno, donde Vera se enfrentó a los indígenas y trato de mantener la neutralidad ante las guerras civiles, el 16 de julio de 1818 fue reelegido gobernador, pero el abandono de sus aliados y el posible enfrentamiento civil, llevó a que el 23 de julio Estanislao López entrara a la capital provincial y asumiera como gobernador de facto, siendo unas semanas más tarde reconocido como titular por el Cabildo.​ Asumiendo López las funciones de gobernador, el director Pueyrredón ideó un plan para Santa Fe por dos frentes, uno con un gran ejército desde Buenos Aires, al mando del general Juan Ramón Balcarce, y otro proveniente de Córdoba, al mando del coronel Juan Bautista Bustos. López repelería ambos avances, con una táctica de ataque y retirada, en Fraile Muerto a Bustos el 8 de noviembre​ y, repitiendo la estrategia de 1816, rechaza en Santa Fe a las tropas de Balcarce, que debe replegarse hacía San Nicólas a finales de noviembre de 1818.

Sin embargo, en enero de 1819, tropas al mando de Lamadrid y Paz fueron a reforzar el ejército de Bustos, mientras Balcarce era reemplazado por Viamonte.​ Una vez más, López atacó primero a Bustos, a quien enfrentó en la batalla de La Herradura, con resultado indefinido.​ Luego, volvería a enfrentar rápidamente a Viamonte, a quien derrota y luego sitiaría en Rosario en marzo de 1919, mientras el general porteño esperaba la ayuda del Ejército del Norte dirigido por Belgrano. A su llegada, lo desgastado que se encontraban ambos bandos, además de la ayuda solicitada por San Martín para el Ejército de los Andes, condujeron a la necesidad de un pacto, que se firmó el 12 de abril en San Lorenzo entre Belgrano y López.

En 1820, López se establecería en Santa Fe, aunque pronto tendría que enfrentar ataques indígenas en el noroeste de la ciudad, Rincón y Coronda, mandando a construir un foso desde la laguna Grande (hoy laguna Setúbal) hasta el río Salado, a modo de defensa. Durante las luchas civiles de 1820, las tropas santafesinas fueron decisivas en la derrota del ejército porteño centralista. Así, con el tiempo, López fue convirtiéndose en el Patriarca de la Federación, estableciéndose como referente del partido Federal hasta su muerte en 1838. Tras la muerte de López fue su secretario y mano derecha, Domingo Cullen el elegido como gobernador, sin embargo, al ser Cullen un potencial rival del gobernador bonaerense y encargado de las relaciones exteriores de la Confederación, Juan Manuel de Rosas, este buscó y consiguió su captura y fusilamiento tras la negociación de Cullen con las fuerzas francesas que bloqueban el puerto de Buenos Aires y por ende significaban una crisis para le economía exportadora de Santa Fe. 

De esta forma Cullen había desafiado la autoridad que Rosas deseaba significar, tras el derrocamiento , Rosas nombró al pro-rosista Juan Pablo López como gobernador. Este nuevo gobernador se mantuvo en el poder, alternándose con Pascual Echagüe, hasta la invasión de la provincia por el Ejército Grande de Justo José de Urquiza, en diciembre de 1851 y durante su mandato se adoptó una nueva Constitución Nacional, el 1 de mayo de 1853.